環境微生(born)物監測培養基及培養條件的(of)選擇

環境微生(born)物監測通常指潔淨區環境沉降菌監測、浮遊菌監測、表面微生(born)物監測（包括設備設施及人(people)員）。

行業内的(of)指導文件或法規對監測用(use)的(of)培養基要(want)求基本上是(yes)一(one)緻的(of)，即：一(one)般采用(use)非選擇性培養基——胰酪大(big)豆胨瓊脂培養基（Tryptone Soya agar  TSA，美國藥典名稱爲(for)soybean–casein digest medium/Soybean–Casein Digest Agar  縮寫SCDM/SCDA），必要(want)時(hour)可加入适宜的(of)中和(and)劑，當有疑似真菌生(born)長時(hour)可使用(use)沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）。但是(yes)對培養條件的(of)要(want)求則不(No)盡統一(one)，有着一(one)定的(of)區别，那我(I)們(them)該如何選擇培養條件呢？

首先我(I)們(them)先看一(one)下各國藥典或行業标準對培養條件的(of)要(want)求。

中國：

GB/T 16293-2010 醫藥工業潔淨室（區）浮遊菌的(of)測試方法

《中國藥典》2020年版四部通則 9205 藥品潔淨實驗室微生(born)物監測和(and)控制指導原則

以(by)上爲(for)GB/T 16293-2010和(and)《中國藥典》對環境監測微生(born)物培養條件的(of)要(want)求，因GB/T 16293-2010相對較早，日常監測中可以(by)主要(want)遵循中國藥典的(of)規定進行培養。也就是(yes)TSA，30-35℃培養3-5天，當需要(want)使用(use)SDA時(hour)，20-25℃培養5-7天。

美國：

USP41-NF36 <1116>MICROBIOLOGICAL CONTROL AND MONITORING OF ASEPTIC PROCESSING ENVIRONMENTS （無菌加工環境的(of)微生(born)物控制和(and)監測）  Official Date: Official Prior to 2013

【翻譯】培養條件的(of)選擇

一(one)旦選擇了(Got it)合适的(of)培養基，就可以(by)設置時(hour)間和(and)培養溫度。通常，對于(At)SCDM等一(one)般微生(born)物生(born)長培養基，使用(use)約20°-35°的(of)培養溫度，培養時(hour)間不(No)少于(At)72小時(hour)。當已知污染物生(born)長緩慢時(hour)，可以(by)考慮較長的(of)培養時(hour)間。上面給出(out)的(of)溫度範圍絕不(No)是(yes)絕對的(of)。典型設施環境中常見的(of)嗜中溫細菌和(and)黴菌通常能夠在(exist)較寬的(of)溫度範圍内生(born)長。對于(At)許多中溫性生(born)物來(Come)說，可以(by)在(exist)大(big)約20°的(of)範圍内進行回收。在(exist)缺乏确鑿證據的(of)情況下，微生(born)物學家可能會在(exist)較低和(and)較高的(of)溫度下培養單個(indivual)平闆。首先在(exist)較低的(of)溫度下培養可能會影響革蘭氏陽性球菌的(of)恢複，這(this)一(one)點很重要(want)，因爲(for)它們(them)通常與人(people)類有關。

FDA  Pharmaceutical Microbiology Manual（制藥微生(born)物手冊）2020

【翻譯】Hycheck載玻片和(and)RODAC平闆應立即在(exist)30-35oC下培養2天，然後在(exist)20oC-25oC下培養5天。當懷疑污染物生(born)長緩慢時(hour)，可能需要(want)更長的(of)培養時(hour)間。每天檢查平闆是(yes)否有菌落形成，以(by)最大(big)限度地(land)減少過度生(born)長對較小菌落的(of)遮擋。

以(by)上爲(for)美國藥典和(and)FDA對環境監測微生(born)物培養條件的(of)規定，都遵循了(Got it)如果采用(use)雙溫度培養時(hour)應先進行高溫培養再進行低溫培養，即先在(exist)30-35℃下培養2天，再轉至20-25℃下培養5天。

WHO：

Environmental Monitoring of Clean Rooms in Vaccine Manufacturing Facilities 世界衛生(born)組織疫苗生(born)産設施潔淨室環境監測 2012

【翻譯】3.3.9.環境樣品的(of)實驗室測試

61.關注的(of)微生(born)物（例如，生(born)産菌株；先前在(exist)EM期間鑒定的(of)菌株；抗性或敏感菌株；或由當地(land)流行條件預測的(of)操作(do)者的(of)潛在(exist)感染）可能需要(want)特殊的(of)捕獲和(and)生(born)長條件。

62.環境監測樣品應在(exist)至少兩個(indivual)溫度下培養，以(by)檢測細菌和(and)真菌。在(exist)實踐中，在(exist)20至25℃下培養3至5天，然後在(exist)30至35℃下再培養2-3天，已被證明足以(by)檢測大(big)多數細菌和(and)真菌。每個(indivual)制造商選擇的(of)方法都應該經過仔細驗證和(and)标準化。當可以(by)一(one)緻地(land)證明關注的(of)微生(born)物的(of)高回收率（>90%）時(hour)，替代方法是(yes)可以(by)接受的(of)。

WHO認爲(for)應先在(exist)20-25℃培養3-5天，再轉至30-35℃培養2-3天。

其他(he)組織相關要(want)求：

ISO 14698-1：2003Cleanrooms and associated controlled environments — Biocontamination control —Part 1:General principles and methods 潔淨室和(and)相關控制環境.生(born)物污染控制.第1部分：一(one)般原理和(and)方法

【翻譯】5.5.3培養

在(exist)爲(for)接種的(of)培養基選擇合适的(of)培養溫度和(and)時(hour)間時(hour)，應盡可能考慮有利于(At)預期進入清潔環境的(of)生(born)物類型生(born)長的(of)條件。

細菌和(and)真菌的(of)總潛伏期分别爲(for)2至5天和(and)5至7天，通常是(yes)可以(by)接受的(of)，尤其是(yes)當菌落單元（VU，viable unit）數量較低時(hour)。當厭氧、嗜熱、微需氧或營養不(No)足或挑剔的(of)細菌和(and)真菌受到(arrive)關注時(hour)，可能需要(want)特定的(of)大(big)氣條件和(and)培養時(hour)間。培養期間應每隔适當的(of)時(hour)間觀察培養皿。

BS EN 17141：2020 Cleanrooms and associated controlled environments — Biocontamination control 潔淨室及其受控環境：生(born)物污染控制

【翻譯】E.4.5平闆培養

培養條件可能因所列舉的(of)關注的(of)微生(born)物而異。

一(one)般來(Come)說，在(exist)30℃至35℃下培養至少3天的(of)總計數适合許多細菌的(of)生(born)長，在(exist)20℃至25℃下至少4天适合一(one)些真菌的(of)生(born)長。培養時(hour)間和(and)溫度應合理。培養溫度保持在(exist)20℃至35℃的(of)範圍内，目标溫度在(exist)2.5℃以(by)内。

PDA TR13 Fundamentals of an Environmental Monitoring Program-2022  環境監測程序基礎

【翻譯】7.5環境監測樣本培育策略和(and)驗證

行業内的(of)指導文件和(and)實踐在(exist)培養條件方面有所不(No)同。關于(At)選擇合适的(of)微生(born)物生(born)長培養基的(of)信息是(yes)可用(use)的(of)，但關于(At)合适的(of)培養時(hour)間和(and)最佳溫度條件的(of)信息是(yes)有限的(of)，有時(hour)是(yes)相互矛盾的(of)。

通常，總需氧菌數可以(by)通過在(exist)30–35°C下培養48–72小時(hour)來(Come)獲得。總的(of)酵母和(and)黴菌總數通常可以(by)通過在(exist)20-25°C下孵育5-7天來(Come)獲得。當已知污染物生(born)長緩慢時(hour)，可以(by)考慮較長的(of)培養時(hour)間。行業調查顯示，大(big)多數公司使用(use)兩種溫度的(of)培養箱，先用(use)較低的(of)溫度。

如果有科學依據并經過驗證，可以(by)采用(use)多種培養方案，以(by)提供适當的(of)靈敏度。這(this)些通常是(yes)基于(At)實驗室的(of)體外研究，使用(use)培養的(of)微生(born)物、參考培養物（如ATCC菌株）和(and)從生(born)産環境中回收的(of)内部分離物的(of)組合。Gordon等人(people)發表的(of)研究表明，體外測試和(and)原位測試之間可能存在(exist)差異（37）。

PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology  PDA藥物科學與技術雜志

Comparison of Different Incubation Conditions for Microbiological Environmental Monitoring（https://journal.pda.org/content/68/5/394）

We found the highest recovery of total aerobic count from areas with personnel flow using a general microbiological growth medium incubated at 30–35 °C. The highest recovery of moulds was obtained with mycological medium incubated at 20–25 °C. Single-plate strategies (two-temperature incubation or an intermediate incubation temperature of 25–30 °C) also yielded reasonable recovery of total aerobic count and moulds. However, recovery of moulds was found to be highly inefficient at 30–35 °C compared to lower incubation temperatures. This deficiency could not be rectified by subsequent incubation at 20–25 °C. 

【翻譯】我(I)們(them)發現，使用(use)在(exist)30–35°C下培養的(of)普通微生(born)物生(born)長培養基，人(people)員流動區域的(of)總需氧菌計數恢複率最高。黴菌的(of)回收率最高的(of)是(yes)在(exist)20–25°C下培養的(of)真菌學培養基。單闆策略（雙溫培養或25-30°C的(of)中間培養溫度）也能合理回收總需氧菌數和(and)黴菌。然而，與較低的(of)培養溫度相比，在(exist)30–35°C下，黴菌的(of)回收效率非常低。這(this)種缺陷無法通過随後在(exist)20-25°C下培養來(Come)糾正。

以(by)上ISO14698-1：2003 沒有給出(out)明确的(of)培養條件，BS EN 17141：2020給出(out)溫度範圍爲(for)20-35℃，并且給出(out)了(Got it)适合細菌和(and)真菌的(of)培養條件但未明确培養條件的(of)先後次序。PDA TR13是(yes)結合了(Got it)各國法規及行業标準給出(out)的(of)大(big)多數公司的(of)一(one)種做法，即先低溫培養後高溫培養，培養的(of)時(hour)間給出(out)了(Got it)一(one)般原則。PDA藥物科學與技術雜志《微生(born)物環境監測不(No)同培養條件的(of)比較》中研究先高溫培養再低溫培養不(No)利于(At)黴菌的(of)生(born)長。

綜合以(by)上法規和(and)行業标準要(want)求，我(I)們(them)如何選擇培養條件呢？以(by)下根據産品銷往或準備銷往的(of)國家提供幾個(indivual)選擇的(of)維度，僅供參考，也希望各種行業标準後期能夠趨于(At)統一(one)要(want)求，至少不(No)是(yes)相互矛盾的(of)：